1. 變性：在第一輪循環(huán)前,在94℃下變性5-10min 非常重要,它可使模板DNAwan全解鏈,然后加入Taq DNA聚合酶(hot start),這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對(duì)的引物與模板復(fù)合物所造成的錯(cuò)誤。變性不wan全,往往使PCR 失敗,因?yàn)槲醋冃詗an全的DNA 雙鏈會(huì)很快復(fù)性,減少DNA 產(chǎn)量.一般變性溫度與時(shí)間為94℃ 1min。在變性溫度下,雙鏈DNA 解鏈只需幾秒鐘即可wan全,所耗時(shí)間主要是為使反應(yīng)體系wan全達(dá)到適當(dāng)?shù)臏囟取?duì)于富含GC 的序列,可適當(dāng)提高變性溫度.但變性溫度過高或時(shí)間過長(zhǎng)都會(huì)導(dǎo)致酶活性的損失。
2. 退火：這是PCR 的一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的Tm 低5℃, 當(dāng)產(chǎn)物中包含有影響實(shí)驗(yàn)的非可異性擴(kuò)增帶時(shí),以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會(huì)減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。如果兩個(gè)引物Tm 不同，將退火溫度設(shè)定為比最di的Tm 低5℃?；蛘邽榱颂岣咛禺愋?，可以在根據(jù)較高Tm 設(shè)計(jì)的退火溫度先進(jìn)行5 個(gè)循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm 設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。退火溫度越高,所得產(chǎn)物的特異性越高。有些反應(yīng)甚至可將退火與延伸兩步合并,只用兩種溫度(例如用60℃和94℃)完成整個(gè)擴(kuò)增循環(huán), 既省時(shí)間又提高了特異性。退火一般僅需數(shù)秒鐘即可完成,反應(yīng)中所需時(shí)間主要是為使整個(gè)反應(yīng)體系達(dá)到合適的溫度。
3. 延伸：延伸反應(yīng)通常為72℃,接近于Taq DNA 聚合酶的最適反應(yīng)溫度75℃.實(shí)際上,引物延伸在退火時(shí)即已開始,因?yàn)門aq DNA 聚合酶的作用溫度范圍可從20℃-85℃.延伸反應(yīng)時(shí)間的長(zhǎng)短取決于目的序列的長(zhǎng)度和濃度.在一般反應(yīng)體系中,Taq DNA聚合酶每分鐘約可合成1kb 長(zhǎng)的DNA。延伸時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加.但對(duì)很低濃度的目的序列, 則可適當(dāng)增加延伸反應(yīng)的時(shí)間。一般在擴(kuò)增反應(yīng)完成后,都需要一步較長(zhǎng)時(shí)間(10-30min)的延伸反應(yīng),以獲得盡可能完整的產(chǎn)物, 這對(duì)以后進(jìn)行克隆或測(cè)序反應(yīng)尤為重要。
4. 循環(huán)次數(shù)： 當(dāng)其它參數(shù)確定之后, 循環(huán)次數(shù)主要取決于DNA 濃度。一般而言25-30輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數(shù)過多,會(huì)使PCR 產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。通常經(jīng)25-30 輪循環(huán)擴(kuò)增后, 反應(yīng)中Taq DNA 聚合酶已經(jīng)不足, 如果此時(shí)產(chǎn)物量仍不夠, 需要進(jìn)一步擴(kuò)增,可將擴(kuò)增的DNA 樣品稀釋103-105倍作為模板, 重新加入各種反應(yīng)底物進(jìn)行擴(kuò)增, 這樣經(jīng)60 輪循環(huán)后, 擴(kuò)增水平可達(dá)109-1010。擴(kuò)增產(chǎn)物的量還與擴(kuò)增效率有關(guān),擴(kuò)增產(chǎn)物的量可用下列公式表示:C＝Co(1+P)n 。其中：C 為擴(kuò)增產(chǎn)物量,C0 為起始DNA 量, P 為增效率, n 為循環(huán)次數(shù)。在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺(tái)效應(yīng)。平臺(tái)期會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，達(dá)到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng)，減少非特異性產(chǎn)物。
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