聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)是在體外進(jìn)行的由引物介導(dǎo)的酶促DNA擴(kuò)增反應(yīng)。PCR的原理是在模板DNA、PCR引物、四種脫氧核糖核苷酸(dNTP)及適當(dāng)濃度的Mg2+存在的條件下，依賴(lài)于DNA聚合酶的體外酶促合成反應(yīng)。根據(jù)PCR使用說(shuō)明進(jìn)行試劑混合預(yù)配，并設(shè)置 PCR 循環(huán)。簡(jiǎn)而言之，PCR需要經(jīng)過(guò)以下循環(huán)：
1. 初始化步驟
這僅對(duì)熱啟動(dòng) PCR 必不ke少。此步驟將溶液加熱至 94-98°C，以激活 DNA 聚合酶。該步驟的時(shí)間取決于所使用的聚合酶。
2. 變性步驟
DNA是雙鏈分子，DNA擴(kuò)增需要引物與單鏈DNA模板相互作用。在此步驟中，將反應(yīng)混合物加熱至 94-98°C 并保持 20-30 秒，以破壞兩條鏈之間的氫鍵并生成單鏈 DNA 分子。此時(shí)進(jìn)入 PCR 循環(huán)。
3. 退火步驟
變性后，反應(yīng)混合物中的 DNA 模板是單鏈的。由于引物與DNA模板互補(bǔ)，當(dāng)反應(yīng)溫度降低到50-65℃時(shí)，引物會(huì)與模板序列匹配，互補(bǔ)堿基之間形成氫鍵。退火溫度取決于所用引物的Tm，一般比引物Tm低3-5℃左右。該步驟將持續(xù)約 20-40 秒以wan全退火，然后聚合酶將定位到引物-模板雜交體以開(kāi)始 DNA 組裝。
4. 伸長(zhǎng)步驟
在此步驟中，DNA 聚合酶開(kāi)始合成 DNA，因此溫度應(yīng)為 DNA 聚合酶的最適溫度。一般選擇 72°C，但有些酶在 68°C 時(shí)效果更好。這一步與體內(nèi)DNA復(fù)制非常相似，DNA聚合酶將dNTPs添加到引物中，以5'到3'方向與模板互補(bǔ)，最終產(chǎn)生新的雙鏈DNA片段。延伸時(shí)間取決于目標(biāo) DNA 片段的長(zhǎng)度和 DNA 聚合酶的能力。一般來(lái)說(shuō)，DNA 聚合酶每 60 秒產(chǎn)生一千個(gè)堿基。
5. 2~4步稱(chēng)為一個(gè)循環(huán)，每循環(huán)一次，目標(biāo)片段量翻倍。一個(gè) PCR 過(guò)程使用 30-35 個(gè)循環(huán)。在 PCR 循環(huán)的早期，PCR 產(chǎn)物以指數(shù)速率積累，而在 PCR 循環(huán)的后期，隨著 dNTPs、引物的減少和 DNA 聚合酶在變性溫度下的失活，反應(yīng)減慢，PCR 速率逐漸下降。
6.最終伸長(zhǎng)率。30-35個(gè)循環(huán)結(jié)束后，在68-74℃的溫度下最終延伸約5-10分鐘，以充分延伸剩余的單鏈DNA。
7.貯存。最終產(chǎn)品可以在 PCR 機(jī)器中維持溫度在 4-10°C。
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