PCR檢測(cè)試劑盒PCR反應(yīng)引物設(shè)計(jì)原則:
PCR反應(yīng)中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。設(shè)計(jì)引物時(shí)以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)），5′端引物與位于待擴(kuò)增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物與位于待擴(kuò)增片段3′端的一小段DNA序列互補(bǔ)。PCR檢測(cè)試劑盒PCR反應(yīng)引物設(shè)計(jì)的基本原則如下：
（1） 引物長(zhǎng)度：15-30 bp，常用為20 bp左右。
（2） 引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
（3） 引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。
（4）兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其是避免3 ′端的互補(bǔ)重疊。
（5） 引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過(guò)70%，引物3′末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。
（6）引物3‘端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，選擇是G和C。
（7） 引物的5 ′端可以修飾。如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物su、熒光物質(zhì)、di 高辛標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。
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